Relatório nº20

As lições nº34 e 35 que se realizaram no dia 25 de outubro com o sumário: Como realizar esfregaços a partir de figuras sólidas. Coloração simples e coloração diferencial de Gram.
Nesta aula a professora começou por entregar a cada um dos alunos uma ficha informativa onde indicava as regras principais da preparação de esfregaços a partir de meios de cultura sólidos.
Ao finalizarmos a leitura aprendemos como mover as bactérias para a lâmina e como utilizar um contador de colónias.
Para finalizar observamos as bactérias no microscópio ótico.

Alexandre Sousa 

Ficha de trabalho 

Escola Secundária Afonso Lopes Vieira

              CURSO PROFISSIONAL DE TÉCNICO AUXILIAR DE SAÚDE

Higiene Segurança e Cuidados Gerais                   Ano Letivo: 2012/13           

Observação Microscópica de bactérias – Coloração de Gram

Embora existam milhares de espécies bacterianas diferentes, os organismos isolados apresentam uma das três formas (fig.2): 1. Elipsoidais ou Esférica (COCOS) - apresentam tipos e arranjos diferentes:

·        Diplococos - dois cocos;

·        Estreptococos - vários cocos arranjados em cadeias;

·        Tétrades - cocos arranjados em 4 – quadrado;

·        Estafilococos - cocos arranjados em cachos de uva;

·        Sarcina - cocos arranjados em forma cúbica;

2. Cilíndricas ou Bastonetes (BACILOS):

·        Diplobacilos - ocorrem em pares;

·        Estreptobacilos - ocorrem em cadeias;

3. Espiraladas ou Helicoidais (ESPIRILOS) e VIBRIÕES- ocorrem predominantemente como células isoladas.

É muito difícil visualizar bactérias vivas, não só por serem muito pequenas mas também porque são transparentes quando suspendidas em meio aquoso. Para estudar propriedades e diferenciar microrganismos, as técnicas de coloração, em conjugação com a microscopia ótica, tornaram-se as melhores ferramentas em microbiologia.

Todos os tipos de coloração requerem a obtenção prévia de esfregaços. A técnica de obtenção de esfregaços, embora não seja difícil requer certos cuidados na sua preparação.

Regras de preparação de esfregaços

1-       Preparação das lâminas de vidro – a utilização de lâminas bem limpas é fundamental para fazer esfregaços de microrganismos. Devem ser lavadas com água e detergente e depois mergulhadas em álcool a 95%. Devem, depois, ser secas e colocadas em toalhas de papel até serem usadas.

2-       Preparação do esfregaço (fig.3).-  É essencial evitar esfregaços “grossos”. Um bom esfregaço é aquele que quando seco se parece com uma fina película de papel de acetato.

Existem duas modalidades de preparar esfregaços:

A- A partir de cultura em meio sólido:

1-Colocar com a ansa uma pequena gota de água sobre a lâmina;

2-Tocar ligeiramente com a ansa esterilizada a superfície da cultura;

3-Suspender o material recolhido na gota de água;

4-Estender a suspensão numa área pequena em movimentos circulares de forma a que o esfregaço fique bem delgado (quanto menor a espessura tanto mais simples será a observação).

	Fig.3

B-A partir de uma cultura em meio líquido:

 Procede-se de modo semelhante ao descrito no parágrafo anterior. Não é necessário colocar água sobre a lâmina, fazendo-se o esfregaço directamente com uma pequena gota de cultura. Isto também é aplicável aos casos de materiais patológicos líquidos ou semilíquidos (pus de abcessos, escarro, exsudados em geral, etc.). No caso em que existam poucas bactérias no meio, poderá haver centrifugação prévia do material, fazendo-se o esfregaço com o sedimento.

3-          Secagem do esfregaço: A secagem espontânea poderá ser acelerada agitando-se a lâmina sobre a zona de ar quente por cima de um bico de Bunsen ou lâmpada. Não se deve aquecer o esfregaço húmido a temperatura superior a que a mão possa resistir.

4-     Fixação pelo calor: Seco o esfregaço, passar três vezes a lâmina sobre a parte mais quente do bico de Bunsen ou cinco vezes na chama da lamparina. Durante esta operação, a face da lâmina contendo o esfregaço deve estar voltada para cima. O movimento da mão sobre a chama deve ser lento mas contínuo a fim de evitar que o esfregaço se carbonize. Deve-se segurar a lâmina obliquamente e pelo extremo inferior, para não provocar queimadura ao fixar a lâmina na chama. Esperar sempre que a lâmina arrefeça para iniciar qualquer tipo de coloração. 

Coloração de esfregaços

Existem variadas técnicas de coloração, baseadas em características morfológicas e estruturas celulares, para visualização, diferenciação e separação de bactérias. Os procedimentos mais usados são os seguintes:

Coloração simples

A coloração simples (com um único corante) permite a visualização da forma morfológica (cocos, bacilos, espirilos) e do arranjo (cadeias, cachos, pares, tétradas) das bactérias

Coloração de Gram

A coloração diferencial requer o uso de, pelo menos, três reagentes químicos que são aplicados sequencialmente no esfregaço fixado pelo calor. O primeiro reagente é chamado corante inicial. A sua função é corar todas as células. Para estabelecer uma coloração contrastante, o segundo reagente usado é um agente descorante. Com base na constituição química dos componentes celulares, o agente descorante pode ou não remover o corante inicial de todas as células ou apenas de certas estruturas celulares. O reagente final, o contra corante, possui uma cor que contrasta com o corante inicial.

Após a descoloração, se o corante inicial não foi removido da estrutura celular, o contra corante não pode ser absorvido e a célula ou os seus componentes celulares reterão a cor do corante inicial. Se o corante inicial for removido, os componentes celulares, descorados, receberão a cor do corante contrastante. Neste caso, os tipos celulares e as suas estruturas podem ser distinguidos, uns dos outros, com base na cor apresentada.

A coloração diferencial mais usada em bacteriologia, é a coloração de Gram, assim chamada em homenagem ao seu descobridor, Dr. Christian Gram.

Esta técnica divide as células bacterianas em dois grandes grupos, Gram positivas e Gram- negativas, sendo considerada o instrumento essencial para a classificação e diferenciação dos microrganismos. O diferente comportamento das bactérias em relação a esta técnica, descorar ou não o corante inicial, deve-se à diferente constituição da parede celular.

A coloração de Gram utiliza quatro reagentes diferentes. A seguir são descritos esses reagentes e mecanismos de Acão.

1-     Corante inicial- Cristal de violeta- Este corante, violeta, é o primeiro a ser usado e cora as células de azul- púrpura

2-     Mordente- Iodina de Gram ou iodo de Gram- Este reagente serve como mordente que intensifica a cor do corante inicial e torna mais difícil a remoção do corante nas bactérias Gram positivas.

3-     Agente descorante- Álcool etílico, 95%- Este reagente possui uma dupla função: remove os lípidos existentes nas paredes bacterianas e desidrata as proteínas também aí existentes. A retirada de lípidos, da parede, vai criar poros nessa parede celular e, como as bactérias Gram negativas possuem lípidos em maior quantidade, esses “buracos” vão ser maiores comparados com os das Gram positivas. Por sua vez, a desidratação das proteínas leva--as a tentarem fechar os poros deixados pela saída dos lípidos. Nas bactérias Gram positivas os poros abertos são “tapados “ pela desidratação das proteínas não deixando sair o corante inicial, enquanto nas Gram negativas os poros são demasiado grandes deixando sair o corante e ficando as células descoradas.

4º- Contra corante- Safranina- É o reagente final para corar de vermelho as células que foram previamente descoradas. Como só as células Gram negativas ficaram descoradas estas podem agora ser coradas pelo corante contrastante. As bactérias Gram positivas retêm a cor do 1º corante.

 A preparação de esfregaços corados adequadamente requer que se tomem as seguintes precauções:

1-     O passo mais crítico do procedimento é o passo de descoloração. Uma descoloração demasiada  resulta na perda de corante inicial fazendo com que os organismos Gram positivos apareçam Gram negativos. Por outro lado, uma descoloração pequena não removerá completamente o corante nas Gram negativas fazendo com que estas bactérias se apresentem Gram positivas. Seguindo à risca as instruções do procedimento ajudará a remediar parte destas dificuldades, mas a experiência e prática individual, são a chave para uma correcta descoloração.

2-     É fundamental que as lâminas sejam cuidadosamente lavadas em água corrente da torneira entre cada aplicação de cada reagente. Este processo remove o reagente excedente e prepara a preparação para a aplicação do reagente subsequente.

3-     As melhores colorações de Gram são alcançadas com preparações de culturas jovens, não mais velhas do que 24 horas. A idade das culturas, principalmente das células Gram positivas, influencia a coloração, pois estes organismos tendem a perder a capacidade de reter o corante inicial e podem variar na coloração de Gram, isto é, algumas células aparecerão azuis, enquanto outras aparecerão vermelhas.

Coloração de Gram de bactérias de colónias das culturas feitas

1-     Faz dois esfregaços de duas colónias diferentes das tuas culturas.

2-     Fixa e cora os dois esfregaços: um por coloração simples e outro por coloração de Gram.

2.1- Coloração simples

A coloração simples (com um único corante) permite a visualização da forma morfológica (cocos, bacilos, espirilos) e do arranjo (cadeias, cachos, pares, tétradas) das bactérias

2.1.1.     Cobre o esfregaço, utilizando um dos corantes a seguir indicados e usando o tempo de exposição suficiente:

- Fucsina fenicada- 30s;

-cristal de violeta – 1 minuto;

- Azul-de-metileno -1 a 2 minutos;

- Safranina- 1 minuto.

2.1.1.     Lava o esfregaço em fio de água da torneira para remover o corante excedente. Neste procedimento, a lâmina deve ser colocada paralelamente ao fio da água da torneira, pois reduzir-se-á a perda de microrganismos da preparação.

2.1.2.     Limpa com cuidado a preparação, utilizando papel de lentes (ou higiénico macio), sem esfregar.

2.2- Cora o outro esfregaço com coloração diferencial, pelo método de Gram. Seguindo os passos da figura 4.

1-     Examina cada esfregaço em óleo de imersão, objetiva 100X. (Nota: nenhum esfregaço deve estar húmido para ser observado, pois não existe lamela sobre a lâmina e poderá danificar as lentes). Para utilizares a objetiva de imersão deves proceder da seguinte forma:

3.1- foca o esfregaço na objetiva de 40,procedendo como já sabes;

3.2- coloca no centro do campo de focagem algo que consigas observar.

3.3- roda o revólver, desalinhando a objetiva em relação ao campo de focagem, de forma as oculares ficarem alinhadas com o espaço entre a objetiva de 40 e a de 100X;

3.4- coloca uma gota de óleo de imersão no esfregaço, na parte alinhada com a fonte de luz;

3.5- roda a objetiva de 100x para a posição de focagem, imergindo-a na gota de óleo;

3.6-ajusta a focagem com o botão micrométrico e ajusta a quantidade de luz de forma a conseguires visualizar bactérias.

1-     Desenha as bactérias que observares, em cada um dos esfregaços e legenda as figuras.

2-     Elabora o procedimento da atividade e apresenta os resultados obtidos na aula.