As lições nº34 e 35 que se
realizaram no dia 25 de outubro com o sumário: Como realizar esfregaços a
partir de figuras sólidas. Coloração simples e coloração diferencial de Gram.
Nesta aula a professora começou por entregar a cada um dos alunos
uma ficha informativa onde indicava as regras principais da preparação de
esfregaços a partir de meios de cultura sólidos.
Ao finalizarmos a leitura aprendemos como mover as bactérias para
a lâmina e como utilizar um contador de colónias.
Para finalizar observamos as bactérias no microscópio ótico.
Alexandre Sousa
Escola
Secundária Afonso Lopes Vieira
CURSO PROFISSIONAL DE TÉCNICO
AUXILIAR DE SAÚDE
Higiene
Segurança e Cuidados Gerais Ano Letivo: 2012/13
Observação
Microscópica de bactérias – Coloração de Gram
Embora existam milhares de espécies bacterianas
diferentes, os organismos isolados apresentam uma das três formas (fig.2): 1. Elipsoidais ou Esférica (COCOS) - apresentam tipos e arranjos
diferentes:
·
Diplococos - dois cocos;
·
Estreptococos - vários cocos arranjados em
cadeias;
·
Tétrades - cocos arranjados em 4 – quadrado;
·
Estafilococos - cocos arranjados em cachos de
uva;
·
Sarcina - cocos arranjados em forma cúbica;
2. Cilíndricas ou Bastonetes (BACILOS):
·
Diplobacilos - ocorrem em pares;
·
Estreptobacilos - ocorrem em cadeias;
3. Espiraladas ou Helicoidais (ESPIRILOS) e VIBRIÕES- ocorrem
predominantemente como células isoladas.
É muito difícil
visualizar bactérias vivas, não só por serem muito pequenas mas também porque são
transparentes quando suspendidas em meio aquoso. Para estudar propriedades e
diferenciar microrganismos, as técnicas de coloração, em conjugação com a
microscopia ótica, tornaram-se as melhores ferramentas em microbiologia.
Todos os tipos de coloração requerem a obtenção prévia de esfregaços. A
técnica de obtenção de esfregaços, embora não seja difícil requer certos
cuidados na sua preparação.
Regras de preparação de
esfregaços
1-
Preparação das lâminas de vidro – a utilização de lâminas
bem limpas é fundamental para fazer esfregaços de microrganismos. Devem ser
lavadas com água e detergente e depois mergulhadas em álcool a 95%. Devem,
depois, ser secas e colocadas em toalhas de papel até serem usadas.
2-
Preparação do esfregaço (fig.3).- É essencial evitar esfregaços “grossos”. Um
bom esfregaço é aquele que quando seco se parece com uma fina película de papel
de acetato.
Existem duas modalidades de preparar esfregaços:
A- A partir de cultura em meio sólido:
1-Colocar com a ansa uma pequena gota de água sobre a lâmina;
2-Tocar ligeiramente com a ansa esterilizada a superfície
da cultura;
3-Suspender o material recolhido na gota de água;
4-Estender a suspensão numa
área pequena em movimentos circulares de forma a que o esfregaço fique bem
delgado (quanto menor a espessura tanto mais simples será a observação).
B-A partir de uma
cultura em meio líquido:
Procede-se de modo semelhante ao descrito no
parágrafo anterior. Não é necessário colocar água sobre a lâmina, fazendo-se o
esfregaço directamente com uma pequena gota de cultura. Isto também é aplicável
aos casos de materiais patológicos líquidos ou semilíquidos (pus de abcessos,
escarro, exsudados em geral, etc.). No caso em que existam poucas bactérias no
meio, poderá haver centrifugação prévia do material, fazendo-se o esfregaço com
o sedimento.
3-
Secagem do esfregaço: A secagem espontânea poderá ser acelerada agitando-se
a lâmina sobre a zona de ar quente por cima de um bico de Bunsen ou lâmpada.
Não se deve aquecer o esfregaço húmido a temperatura superior a que a mão possa
resistir.
4-
Fixação pelo calor: Seco o esfregaço, passar três vezes a lâmina sobre a
parte mais quente do bico de Bunsen ou cinco vezes na chama da lamparina.
Durante esta operação, a face da lâmina contendo o esfregaço deve estar voltada
para cima. O movimento da mão sobre a chama deve ser lento mas contínuo a fim
de evitar que o esfregaço se carbonize. Deve-se segurar a lâmina obliquamente e
pelo extremo inferior, para não provocar queimadura ao fixar a lâmina na chama.
Esperar sempre que a lâmina arrefeça para iniciar qualquer tipo de
coloração.
Coloração de esfregaços
Existem variadas técnicas
de coloração, baseadas em características morfológicas e estruturas celulares,
para visualização, diferenciação e separação de bactérias. Os procedimentos
mais usados são os seguintes:
Coloração simples
A coloração simples (com um único
corante) permite a visualização da forma morfológica (cocos, bacilos,
espirilos) e do arranjo (cadeias, cachos, pares, tétradas) das bactérias
Coloração de Gram
A coloração diferencial
requer o uso de, pelo menos, três reagentes químicos que são aplicados
sequencialmente no esfregaço fixado pelo calor. O primeiro reagente é chamado corante
inicial. A sua função é corar todas as células. Para estabelecer uma
coloração contrastante, o segundo reagente usado é um agente descorante.
Com base na constituição química dos componentes celulares, o agente descorante
pode ou não remover o corante inicial de todas as células ou apenas de certas
estruturas celulares. O reagente final, o contra corante, possui uma cor
que contrasta com o corante inicial.
Após a descoloração, se o
corante inicial não foi removido da estrutura celular, o contra corante não
pode ser absorvido e a célula ou os seus componentes celulares reterão a cor do
corante inicial. Se o corante inicial for removido, os componentes celulares,
descorados, receberão a cor do corante contrastante. Neste caso, os tipos
celulares e as suas estruturas podem ser distinguidos, uns dos outros, com base
na cor apresentada.
A coloração diferencial
mais usada em bacteriologia, é a coloração de Gram, assim chamada em homenagem
ao seu descobridor, Dr. Christian Gram.
Esta técnica divide as
células bacterianas em dois grandes grupos, Gram positivas e Gram- negativas,
sendo considerada o instrumento essencial para a classificação e diferenciação
dos microrganismos. O diferente comportamento das bactérias em relação a esta
técnica, descorar ou não o corante inicial, deve-se à diferente constituição da
parede celular.
A coloração de Gram
utiliza quatro reagentes diferentes. A seguir são descritos esses reagentes e
mecanismos de Acão.
1-
Corante inicial- Cristal de violeta- Este corante, violeta, é o primeiro a ser usado e cora
as células de azul- púrpura
2-
Mordente- Iodina de Gram ou iodo de Gram- Este reagente serve como mordente que
intensifica a cor do corante inicial e torna mais difícil a remoção do corante
nas bactérias Gram positivas.
3-
Agente descorante- Álcool etílico, 95%- Este reagente possui uma dupla
função: remove os lípidos existentes nas paredes bacterianas e desidrata as
proteínas também aí existentes. A retirada de lípidos, da parede, vai criar
poros nessa parede celular e, como as bactérias Gram negativas possuem lípidos
em maior quantidade, esses “buracos” vão ser maiores comparados com os das Gram
positivas. Por sua vez, a desidratação das proteínas leva--as a tentarem fechar
os poros deixados pela saída dos lípidos. Nas bactérias Gram positivas os poros
abertos são “tapados “ pela desidratação das proteínas não deixando sair o
corante inicial, enquanto nas Gram negativas os poros são demasiado grandes
deixando sair o corante e ficando as células descoradas.
4º-
Contra corante- Safranina- É o reagente final para corar de vermelho as células que foram
previamente descoradas. Como só as células Gram negativas ficaram descoradas estas
podem agora ser coradas pelo corante contrastante. As bactérias Gram positivas
retêm a cor do 1º corante.
A preparação de esfregaços corados
adequadamente requer que se tomem as seguintes precauções:
1-
O
passo mais crítico do procedimento é o passo de descoloração. Uma descoloração
demasiada resulta na perda de corante
inicial fazendo com que os organismos Gram positivos apareçam Gram negativos.
Por outro lado, uma descoloração pequena não removerá completamente o corante
nas Gram negativas fazendo com que estas bactérias se apresentem Gram
positivas. Seguindo à risca as instruções do procedimento ajudará a remediar
parte destas dificuldades, mas a experiência e prática individual, são a chave
para uma correcta descoloração.
2-
É
fundamental que as lâminas sejam cuidadosamente lavadas em água corrente da
torneira entre cada aplicação de cada reagente. Este processo remove o reagente
excedente e prepara a preparação para a aplicação do reagente subsequente.
3-
As
melhores colorações de Gram são alcançadas com preparações de culturas jovens,
não mais velhas do que 24 horas. A idade das culturas, principalmente das
células Gram positivas, influencia a coloração, pois estes organismos tendem a
perder a capacidade de reter o corante inicial e podem variar na coloração de
Gram, isto é, algumas células aparecerão azuis, enquanto outras aparecerão
vermelhas.
Coloração de Gram
de bactérias de colónias das culturas feitas
1- Faz
dois esfregaços de duas colónias diferentes das tuas culturas.
2- Fixa
e cora os dois esfregaços: um por coloração simples e outro por coloração de
Gram.
2.1- Coloração simples
A coloração simples (com um único
corante) permite a visualização da forma morfológica (cocos, bacilos,
espirilos) e do arranjo (cadeias, cachos, pares, tétradas) das bactérias
2.1.1.
Cobre
o esfregaço, utilizando um dos corantes a seguir indicados e usando o tempo de
exposição suficiente:
- Fucsina fenicada- 30s;
-cristal de violeta – 1
minuto;
- Azul-de-metileno -1 a 2 minutos;
- Safranina- 1 minuto.
2.1.1.
Lava
o esfregaço em fio de água da torneira para remover o corante excedente. Neste
procedimento, a lâmina deve ser colocada paralelamente ao fio da água da
torneira, pois reduzir-se-á a perda de microrganismos da preparação.
2.1.2.
Limpa
com cuidado a preparação, utilizando papel de lentes (ou higiénico macio), sem
esfregar.
2.2- Cora o outro
esfregaço com coloração diferencial, pelo método de Gram. Seguindo os passos da
figura 4.
1- Examina cada esfregaço em óleo de
imersão, objetiva 100X. (Nota: nenhum
esfregaço deve estar húmido para ser observado, pois não existe lamela sobre a
lâmina e poderá danificar as lentes).
Para utilizares a objetiva de imersão deves proceder da seguinte forma:
3.1- foca o
esfregaço na objetiva de 40,procedendo como já sabes;
3.2- coloca no
centro do campo de focagem algo que consigas observar.
3.3- roda o
revólver, desalinhando a objetiva em relação ao campo de focagem, de forma as
oculares ficarem alinhadas com o espaço entre a objetiva de 40 e a de 100X;
3.4- coloca uma gota
de óleo de imersão no esfregaço, na parte alinhada com a fonte de luz;
3.5- roda a objetiva
de 100x para a posição de focagem, imergindo-a na gota de óleo;
3.6-ajusta a focagem
com o botão micrométrico e ajusta a quantidade de luz de forma a conseguires
visualizar bactérias.
1- Desenha
as bactérias que observares, em cada um dos esfregaços e legenda as figuras.
2- Elabora
o procedimento da atividade e apresenta os resultados obtidos na aula.
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